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乙醛脱氢酶的发酵、分离及纯化

林德俊 2010

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乙醛脱氢酶的发酵、分离及纯化
著者: 林德俊
描述: 硕士: 生物材料与组织工程; Q554.9; 乙醛脱氢酶（AldehydeDehydrogenase，ALDH）是参与人体内乙醛代谢的关键性酶之一，能够催化多种脂肪族和芳香族的醛类氧化为相应的酸，从而降低醛类物质在体内的毒性。由此可见，乙醛脱氢酶具有潜在的重要药用价值。目前，ALDH主要是利用色谱柱技术从微生物和动物细胞中分离提取，费用高、纯化产率低且难以大规模生产。随着该酶的需求增大，如何简便快速地获得大量纯化的乙醛脱氢酶成为研究的重点。　　本文以实验室重组得到的6株毕赤酵母GS115（含ALDH基因）为出发点，根据酵母培养手册对菌株进行培养、添加甲醇诱导表达，筛选得到1株表达水平较高的菌株，并确定了乙醛脱氢酶表达的最适条件：甲醇诱导最佳时间为96h，酶活可达55U/mL。将该菌株接种到20L发酵罐中，研究其高密度培养放大表达乙醛脱氢酶的可行性。重组酵母培养36h后进入甲醇诱导阶段，48h后酶活达到最大（180U/mL），继续诱导发现酶活逐渐下降。对比摇瓶实验结果，乙醛脱氢酶的表达量增大了2倍。发酵液粗酶活性质研究发现：以乙醛为底物，重组获得的乙醛脱氢酶最适反应pH为4.0，温度为40℃，二价离子对酶活存在较大差异，其中Zn2+、Mn2+、Mg2+有激活效果，Fe2+、Cu2+有抑制作用。　　电泳结果显示发酵液中存在少量杂蛋白，需对其中的酶进行分离纯化。以PEG/（NH4）2SO4双水相体系相图为基础，利用双水相技术萃取乙醛脱氢酶，研究体系中PEG分子量、体系结线TLL、相比VR、pH值及添加氯化钠对酶分配行为的影响。最适条件为：在PEG2000/（NH4）2SO4双水相体系中，当体系结线TLL为10.2％，上下相比VR为1.26，pH值为4.0且NaCl浓度为1％（w/w）时，乙醛脱氢酶获得最大回收率和纯化倍数，分别为62％和4.6。萃取前后电泳检测结果显示，以PEG/（NH4）2SO4双水相体系纯化ALDH，基本上能获得单一的乙醛脱氢酶条带。
出版者: 东南大学
建立日期: 2010
語言: 中文
資源來源: 学位论文 (Dissertations of China)

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乙醛脱氢酶的发酵、分离及纯化

林德俊 2010

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