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乙醛脱氢酶的发酵、分离及纯化
林
德
俊
2010
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題名:
乙醛脱氢酶的发酵、分离及纯化
著者:
林
德
俊
描述:
硕士: 生物材料与组织工程; Q554.9; 乙醛脱氢酶(AldehydeDehydrogenase,ALDH)是参与人体内乙醛代谢的关键性酶之一,能够催化多种脂肪族和芳香族的醛类氧化为相应的酸,从而降低醛类物质在体内的毒性。由此可见,乙醛脱氢酶具有潜在的重要药用价值。目前,ALDH主要是利用色谱柱技术从微生物和动物细胞中分离提取,费用高、纯化产率低且难以大规模生产。随着该酶的需求增大,如何简便快速地获得大量纯化的乙醛脱氢酶成为研究的重点。 本文以实验室重组得到的6株毕赤酵母GS115(含ALDH基因)为出发点,根据酵母培养手册对菌株进行培养、添加甲醇诱导表达,筛选得到1株表达水平较高的菌株,并确定了乙醛脱氢酶表达的最适条件:甲醇诱导最佳时间为96h,酶活可达55U/mL。将该菌株接种到20L发酵罐中,研究其高密度培养放大表达乙醛脱氢酶的可行性。重组酵母培养36h后进入甲醇诱导阶段,48h后酶活达到最大(180U/mL),继续诱导发现酶活逐渐下降。对比摇瓶实验结果,乙醛脱氢酶的表达量增大了2倍。发酵液粗酶活性质研究发现:以乙醛为底物,重组获得的乙醛脱氢酶最适反应pH为4.0,温度为40℃,二价离子对酶活存在较大差异,其中Zn2+、Mn2+、Mg2+有激活效果,Fe2+、Cu2+有抑制作用。 电泳结果显示发酵液中存在少量杂蛋白,需对其中的酶进行分离纯化。以PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图为基础,利用双水相技术萃取乙醛脱氢酶,研究体系中PEG分子量、体系结线TLL、相比VR、pH值及添加氯化钠对酶分配行为的影响。最适条件为:在PEG2000/(NH4)2SO4双水相体系中,当体系结线TLL为10.2%,上下相比VR为1.26,pH值为4.0且NaCl浓度为1%(w/w)时,乙醛脱氢酶获得最大回收率和纯化倍数,分别为62%和4.6。萃取前后电泳检测结果显示,以PEG/(NH4)2SO4双水相体系纯化ALDH,基本上能获得单一的乙醛脱氢酶条带。
出版者:
东南大学
建立日期:
2010
語言:
中文
資源來源:
学位论文 (Dissertations of China)
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